Protocole d'élimination du charbon de bois FBS : Déplétion hormonale et stéroïdienne
26 Feb 2026
Qu'est-ce que le délipidation au charbon actif du SBF ?
La délipidation au charbon actif est une méthode de retrait sélectif des substances lipophiles du Sérum Bovin Fœtal (SBF), notamment les hormones stéroïdes, les facteurs de croissance et d'autres petites molécules hydrophobes. Grâce à un traitement avec du charbon actif enrobé de dextrane (DCC), ces substances sont adsorbées tandis que les composants sériques polaires (acides aminés, sels, glucose) sont en grande partie préservés.
Applications
Le SBF délipidé au charbon actif (SBF-CA) est essentiel pour :
- Recherche hormonale – Études sur les œstrogènes, les androgènes, la progestérone sans interférence endogène
- Recherche sur le cancer – Cellules de cancer du sein à récepteurs hormonaux positifs (MCF-7, T47D)
- Études d'adipogenèse – Différenciation des préadipocytes sans facteurs de confusion
- Perturbateurs endocriniens – Test de l'activité hormonale des produits chimiques
- Recherche sur les voies de signalisation – Expériences de réintroduction contrôlée
💡 Avantage : Le SBF-CA permet un contrôle expérimental sur les concentrations hormonales. En éliminant les hormones endogènes, des hormones exogènes peuvent être ajoutées à des concentrations définies, permettant des études dose-réponse reproductibles.
Substances retirées par délipidation au charbon actif
Cibles primaires (fortement déplétées)
| Classe de substance | Exemples | Réduction |
|---|---|---|
| Hormones stéroïdes | Estradiol, Progestérone, Testostérone, Cortisol | >95% |
| Hormones thyroïdiennes | T3, T4 | >90% |
| Acides gras | Acides gras libres, vitamines lipophiles | 70-90% |
| Facteurs de croissance lipophiles | TGF-β partiel, facteurs associés aux lipides | 30-70% |
| Petites molécules lipophiles | Vitamine D, Rétinoïdes | 60-80% |
Composants préservés (peu affectés)
- ✓ Acides aminés (pas de réduction significative)
- ✓ Glucose (stable)
- ✓ Sels et électrolytes (stables)
- ✓ Albumine (>95% retenue)
- ✓ Transferrine (largement retenue)
- ✓ Immunoglobulines (principalement retenues)
- ✓ Facteurs de croissance polaires (EGF, FGF partiellement retenus)
⚠️ Important : La délipidation au charbon actif n'est pas sélective pour les hormones uniquement. D'autres facteurs de croissance lipophiles et cytokines sont également partiellement éliminés. Cela peut entraîner une réduction de la croissance cellulaire. Recommandation : Utiliser 15-20% de SBF-CA au lieu de 10% de SBF standard dans le milieu de culture.
Méthode du charbon actif enrobé de dextrane (DCC)
Pourquoi un enrobage de dextrane ?
Le charbon actif seul est très non spécifique et adsorbe de grandes protéines (albumine, globulines), entraînant une perte massive de protéines.
L'enrobage de dextrane (Dextrane T-70, 70 kDa) forme une barrière stérique :
- ✓ Bloque l'adsorption des grandes protéines (>50 kDa)
- ✓ Permet l'adsorption des petites molécules lipophiles (<5 kDa)
- ✓ Réduit la perte non spécifique de protéines de 70-80%
- ✓ Améliore la reproductibilité entre les lots
Protocole validé de délipidation au charbon actif
Matériel requis
Réactifs :- Charbon actif Norit A (ou équivalent)
- Dextrane T-70 (poids moléculaire 70 kDa)
- Saccharose
- MgCl₂ (Chlorure de magnésium)
- Tampon HEPES
- SBF (sérum à délipider)
- Bouteilles/conteneurs stériles
- Centrifugeuse (minimum 3000 x g)
- Mélangeur Vortex
- Incubateur rotatif (optionnel, recommandé)
- Unité de filtration stérile (0,22 µm)
- Réfrigérateur (+4°C) ou incubateur (56°C)
Protocole étape par étape
Jour 1 : Préparation de la suspension de DCC
| Étape | Action | Détails |
|---|---|---|
| 1 | Préparer le tampon de délipidation |
Composition : - 0,25 M Saccharose (85,6 g/L) - 1,5 mM MgCl₂ (0,31 g/L) - 10 mM HEPES pH 7,4 (2,38 g/L) Dissoudre dans de l'eau désionisée, ajuster le pH |
| 2 | Suspendre le charbon actif |
Concentration : 2,5 g/L (0,25%) Charbon actif Norit A dans le tampon de délipidation Mélanger soigneusement (vortex) |
| 3 | Ajouter le Dextrane T-70 |
Concentration : 0,25 g/L (0,025%) Dextrane T-70 à la suspension de charbon Mélanger jusqu'à dissolution complète |
| 4 | Incubation pendant la nuit | Incuber à +4°C pendant la nuit Rotation (lente) ou agitateur magnétique Permet un enrobage uniforme de dextrane |
Jour 2 : Délipidation au charbon actif
| Étape | Action | Détails |
|---|---|---|
| 5 | Équilibrer le DCC | Amener la suspension de DCC à température ambiante Bien mélanger (s'est sédimenté pendant la nuit) |
| 6 | Culoter le DCC | Centrifugation : 3000 x g, 10 min Jeter le surnageant Le culot de charbon reste |
| 7 | Ajouter le SBF |
Ratio : 1:1 (volume de DCC : volume de SBF) Exemple : 100 mL de culot de DCC + 100 mL de SBF Combiner dans une bouteille stérile |
| 8 | Incubation et mélange |
Option A (Standard) : 4°C, 24h, rotation Option B (+ Inactivation thermique) : 56°C, 45 min, rotation Vortex toutes les 10-15 min à 56°C |
| 9 | Centrifugation |
3000-4000 x g, 20 min, 4°C Le charbon est complètement culoté Surnageant = SBF-CA (encore trouble) |
| 10 | 2ème délipidation (Optionnel mais recommandé) | SBF-CA avec nouvelle suspension de DCC Répéter les étapes 5-9 Augmente la déplétion à >95% |
| 11 | Filtration stérile |
Filtre 0,22 µm Élimine les résidus de charbon SBF-CA clair obtenu |
| 12 | Contrôle qualité et stockage | Inspection visuelle (clair, légèrement jaune) Répartir en aliquots dans des bouteilles stériles Stockage : -20°C, jusqu'à 12 mois |
Paramètres critiques et optimisation
Ratio charbon/sérum
| Ratio (DCC:SBF) | Déplétion hormonale | Perte de protéines | Application |
|---|---|---|---|
| 0,5:1 | ~70-80% | Minimale (5-10%) | Déplétion modérée, rétention maximale des protéines |
| 1:1 (Standard) | ~85-95% | Modérée (10-15%) | Recommandé pour la plupart des applications |
| 2:1 | >95% | Élevée (15-25%) | Déplétion maximale, perte de protéines plus élevée |
Température et temps
4°C, 24 heures (Standard) :
- ✓ Méthode la plus douce
- ✓ Perte minimale de protéines
- ✓ Préserve les facteurs thermosensibles
- Temps de traitement plus long
56°C, 45 minutes (+ Inactivation thermique) :
- ✓ Combine délipidation + inactivation du complément
- ✓ Processus plus rapide
- Facteurs thermosensibles partiellement endommagés
- Perte de protéines légèrement augmentée
💡 Recommandation : Pour une déplétion hormonale maximale avec une perte de protéines minimale : Double délipidation à 4°C (2x 24h avec du DCC frais). Cela permet une réduction hormonale de >95% avec seulement 15-20% de perte de protéines.
Contrôle qualité et validation
Inspection visuelle
✓ Acceptable :
- Clair à légèrement opalescent
- Légère coloration jaune (normale)
- Pas de particules visibles après filtration
✗ Non acceptable :
- Très trouble (centrifugation incomplète)
- Particules noires (contamination par le charbon)
- Décoloration brune (sur-traitement)
Tests biochimiques
| Test | SBF standard | SBF-CA (Cible) | Méthode |
|---|---|---|---|
| Estradiol (17β-E2) | 100-500 pg/mL | <10 pg/mL (<10⁻¹¹ M) | ELISA, LC-MS/MS |
| Testostérone | 50-200 ng/dL | <5 ng/dL | ELISA |
| Protéines totales | 35-45 g/L | 28-38 g/L (80-90%) | Bradford/BCA |
| Albumine | 15-20 g/L | 14-19 g/L (>90%) | Test BCG |
Essai fonctionnel
Test de prolifération MCF-7 (Standard pour la déplétion œstrogénique) :
- Cultiver des cellules MCF-7 dans du SBF-CA (3-5 jours)
- Traiter avec/sans 17β-Estradiol (10⁻⁹ M)
- Mesurer la prolifération (MTT, BrdU, numération cellulaire)
- Attente : Croissance minimale sans E2, forte stimulation avec E2
- Contrôle : ICI 182,780 (antagoniste des ER) devrait bloquer l'effet de l'E2
⚠️ Variabilité lot-à-lot : Le SBF-CA présente une variabilité de lot plus élevée que le SBF standard. Recommandation : Valider chaque lot de SBF-CA avec un essai MCF-7 avant les expériences critiques. Différentes sources de SBF peuvent nécessiter une intensité de délipidation différente.
Dépannage
Problème : Activité hormonale résiduelle (déplétion incomplète)
Symptômes : Les cellules MCF-7 prolifèrent même sans ajout d'E2
Causes et solutions :
- Délipidation insuffisante : Effectuer une 2ème série de délipidation
- Ratio de charbon trop faible : Augmenter à 1:1 ou 2:1
- Lot de SBF avec une teneur élevée en hormones : Tester une source de SBF différente
- Temps d'incubation trop court : Prolonger à 24h à 4°C
Problème : Croissance cellulaire réduite même avec des hormones
Symptômes : Croissance généralement faible dans le SBF-CA
Causes et solutions :
- Délipidation trop agressive : Les facteurs de croissance sont co-déplétés → Augmenter la concentration de SBF-CA à 15-20%
- Perte de protéines trop élevée : Augmenter la concentration de dextrane (0,05%), réduire le temps de délipidation
- Contamination par le charbon : Meilleure centrifugation (force g plus élevée), filtration supplémentaire
Problème : Résultats incohérents entre les lots
Causes et solutions :
- La qualité du SBF varie : Délipider une plus grande quantité du même lot de SBF
- Protocole de délipidation incohérent : Standardiser (toujours le même temps, la même température, le même ratio)
- L'activité du charbon fluctue : Valider le lot de charbon, toujours utiliser le même lot
Bonnes pratiques
✓ Procédures recommandées
- criblage des lots de SBF : Tester plusieurs lots de SBF, sélectionner le matériel de départ à faible teneur hormonale
- Protocole standardisé : Documenter et suivre de manière cohérente (température, temps, ratio)
- Double délipidation : Toujours délipider 2 fois pour les études hormonales critiques
- Validation fonctionnelle : Tester chaque lot avec la lignée cellulaire pertinente
- Grands lots : Délipider 1 à 2 L à la fois, aliquoter, congeler → réduit la variabilité inter-lots
- Contrôle négatif : Toujours utiliser du SBF standard en parallèle dans les expériences
Directives d'application
Formulations de milieux avec SBF-CA
Culture standard :
- 15-20% de SBF-CA (au lieu de 10% de SBF standard)
- La concentration accrue compense la perte de facteurs de croissance
Privation hormonale (starvation) :
- 2-5% de SBF-CA pendant 24-72h avant la réintroduction hormonale
- Minimise l'exposition hormonale résiduelle
Courbes dose-réponse :
- 5-10% de SBF-CA comme milieu de base
- Titration hormonale : 10⁻¹² à 10⁻⁸ M typique pour l'estradiol
SBF délipidé au charbon actif SeamlessBio
SeamlessBio propose un SBF délipidé au charbon actif professionnellement, avec une validation complète :
- ✓ Double délipidation avec du charbon actif enrobé de dextrane
- ✓ Niveaux d'estradiol <10 pg/mL (validés par ELISA)
- ✓ >90% de rétention des protéines (par rapport au SBF non délipidé)
- ✓ Test fonctionnel MCF-7 pour chaque lot
- ✓ Origines approuvées par l'USDA (USA, Australie, Nouvelle-Zélande)
- ✓ Combinaison optionnelle avec inactivation thermique ou irradiation gamma
- ✓ Certificat d'analyse avec les niveaux d'hormones
- ✓ Performance constante lot à lot
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Références
- Sigma-Aldrich. Protocole de délipidation du SBF au charbon actif pour dépleter les hormones. Document technique.
- Sikora MJ, Johnson MD, Lee AV, Oesterreich S. (2016). Endocrine Response Phenotypes Are Altered by Charcoal-Stripped Serum Variability. Endocrinology 157(10):3760-3766.
- Thermo Fisher Scientific. Bulletin technique SBF délipidé au charbon actif. 2024.
- Lippman M, Bolan G, Huff K. (1976). The effects of estrogens and antiestrogens on hormone-responsive human breast cancer in long-term tissue culture. Cancer Res 36(12):4595-601.
- Capricorn Scientific. Informations produit SBF délipidé au charbon actif. 2024.
Protocoles supplémentaires de traitement du SBF
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- Inactivation thermique (56°C, 30 min) – Inactivation du complément
- Irradiation gamma (25-45 kGy) – Inactivation virale et mycoplasmique
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